流行性乙型腦炎病毒研究進(jìn)展
作者：鄧淑珍，張海林，李金梅 作者單位：1.大理學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，云南 大理 671000； 2.云南省地方病防治所/云南省病毒立克次體研究中心，云南 大理 671000.
【摘要】 流行性乙型腦炎病死率較高，后遺癥嚴(yán)重，在亞洲地區(qū)危害較大。本文就乙腦病毒的分類、抗原特性、對(duì)細(xì)胞和動(dòng)物敏感性、基因組的結(jié)構(gòu)特征、毒力基因、基因分型和疫苗等方面的研究進(jìn)展作一綜述。
【關(guān)鍵詞】 流行性乙型腦炎病毒；生物學(xué)特性；分子特征；疫苗
流行性乙型腦炎（簡(jiǎn)稱乙腦）國(guó)際上稱為日本腦炎（Japanese encephalitis）。本病是由日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus）經(jīng)蚊蟲(chóng)媒介叮咬傳播而引起的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的急性傳染病，也是一種人獸共患的自然疫源性疾病。臨床上以高熱、意識(shí)障礙、抽搐、呼吸衰竭及腦膜刺激征為特征。病死率較高，而且后遺癥嚴(yán)重。本病對(duì)人類健康危害較大，現(xiàn)就乙腦的病原學(xué)研究進(jìn)展綜述如下。
1 乙腦病毒分類及抗原特性
乙腦病毒在分類上屬于黃病毒科（F1aviviridae）黃病毒屬（F1avivirus）成員。在黃病毒屬中按抗原組劃分，乙腦病毒抗原組包括乙腦、西尼羅和圣路易腦炎病毒。黃病毒成員之間存在著不同程度的血清學(xué)抗體交叉反應(yīng)，而抗原組內(nèi)不同病毒之間交叉反應(yīng)更為嚴(yán)重，因此在血清學(xué)檢測(cè)和判定時(shí)要充分考慮相關(guān)病毒交叉的可能［1,2］。
2 乙腦病毒對(duì)細(xì)胞和動(dòng)物敏感性
乙腦病毒能在BHK21、Vero、LLC-MK、C6/36等傳代細(xì)胞或猴腎、地鼠腎、雞胚纖維母細(xì)胞和豬腎等原代細(xì)胞中增殖，并產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。細(xì)胞感染病毒后第3～5d開(kāi)始出現(xiàn)CPE，病變的特點(diǎn)是單層細(xì)胞出現(xiàn)變圓、脫落及破裂，在C6/36細(xì)胞上可出現(xiàn)細(xì)胞融合形成空泡。C6/36細(xì)胞是乙腦病毒最為敏感的細(xì)胞，已廣泛應(yīng)用于乙腦病毒的分離和有關(guān)研究中。乙腦病毒能在BHK21、LLC-MK2和Vero等細(xì)胞上產(chǎn)生蝕斑。乙腦病毒腦內(nèi)接種乳小白鼠較為敏感，乳鼠可出現(xiàn)以馳緩性麻痹為主的腦炎癥狀而死亡。潛伏期3～4d。主要癥狀是行動(dòng)遲緩、離群、聳毛、尾強(qiáng)直、抽搐、四肢麻痹，最終死亡。該病毒也能引起幼年小白鼠（8～10g）或成年鼠發(fā)病死亡。
3 乙腦病毒基因組的結(jié)構(gòu)特征
乙腦病毒基因組為單股正鏈RNA，全長(zhǎng)約11kb，乙腦病毒各地代表株的全核苷酸序列均有發(fā)表。乙腦病毒的基因結(jié)構(gòu)為5’端有95個(gè)核苷酸的非編碼區(qū)接著一段10 296個(gè)核苷酸的編碼區(qū)，隨后是585個(gè)核苷酸的3’ 端的非編碼區(qū)。乙腦病毒的基因組只有一個(gè)開(kāi)放讀碼框，其編碼是由3個(gè)432個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白前體，該多聚蛋白前體在宿主細(xì)胞內(nèi)，在病毒自身編碼的蛋白酶（NS3）及胞內(nèi)其它酶類作用下，形成3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（C，PrM和E）和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5），基因順序?yàn)椋?/span>5’cap-NCR-C-PrM-M-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3’NCR（cap：帽狀結(jié)構(gòu)，NCR：非編碼區(qū)，C：核衣殼蛋白，PrM：前膜蛋白，M：膜蛋白，E：包膜糖蛋白；NS：非結(jié)構(gòu)蛋白）［3,4］。PrM、E和NS1糖基化，均有免疫保護(hù)作用。prM蛋白是未成熟病毒體的一部分，在病毒感染后期，它可以誘導(dǎo)保護(hù)性免疫，E蛋白基因大小為1 500 bp，編碼500個(gè)氨基酸殘基，囊膜糖蛋白E是主要的毒力抗原，E蛋白上有特異性抗體的中和表位，可誘導(dǎo)免疫動(dòng)物產(chǎn)生中和抗體。NS1是糖基化蛋白，為乙腦病毒的保護(hù)性抗原，而NS1蛋白為可溶性補(bǔ)體固定原。
4 乙腦病毒毒力基因
已發(fā)現(xiàn)影響乙腦病毒毒力的相關(guān)因素很多, 如病毒與細(xì)胞受體結(jié)合的能力、病毒與細(xì)胞融合的速率、病毒RNA 合成酶的合成速率等,都會(huì)不同程度地影響該病毒的毒力。通過(guò)對(duì)減毒株和野毒株的比較研究發(fā)現(xiàn)影響乙腦病毒毒力的7個(gè)共有氨基酸突變位點(diǎn)，即E138（Glu-Lys）、E176(Ile-Val)、E315(Ala-Val)、E439(Lys-Arg)、Ns2-63（Glu-Asp）、NS3-105((Ala-Gly)、NS4B(Ile- Val),其中有4個(gè)位點(diǎn)集中在E基因區(qū)，其余變異位點(diǎn)分布在非結(jié)構(gòu)基因，表明影響毒力的因素不僅限于 E基因。其它一些突變位點(diǎn)屬于非共同的氨基酸突變位點(diǎn)，分別分布在結(jié)構(gòu)基因和非結(jié)構(gòu)基因部位，但這些非共同的氨基酸突變位點(diǎn)是否對(duì)乙腦病毒毒力有影響尚需進(jìn)一步研究［5,6］。
Sumiyoshi等的研究也證明，E蛋白在乙腦病毒毒力中占有重要位置，E基因的單點(diǎn)突變即可使乙腦病毒喪失其神經(jīng)毒力/侵襲力［7］。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，SA14-14-2減毒株與其母株SA14野毒株的E區(qū)比較共有8個(gè)氨基酸殘基差異，具體位置在E107、E138、E176、E177、E264、E279、E315和E439位，是毒力減弱的關(guān)鍵氨基酸殘基位點(diǎn)［6,8］。還發(fā)現(xiàn)AT31和AT222E蛋白上E138和E176位點(diǎn)氨基酸變化可能改變了E蛋白對(duì)細(xì)胞受體的吸附性，或者引起該病毒對(duì)其他細(xì)胞不可穿透，導(dǎo)致病毒毒力減弱，E138和E176一起對(duì)乙腦病毒強(qiáng)毒株在連續(xù)性傳代過(guò)程中毒力減弱起了關(guān)鍵作用，這2個(gè)位點(diǎn)上的氨基酸是決定乙腦病毒病原性的關(guān)鍵氨基酸，與乙腦病毒神經(jīng)毒力密切相關(guān)［9］。因此，利用E蛋白這一分子生物學(xué)特性，以開(kāi)發(fā)更有效，更廉價(jià)的乙腦疫苗［10,11］。
5 乙腦病毒基因分型
首先由Takegami（1982）將乙腦病毒分為 3 個(gè)血清型（Ja Gar、 Nakayama 和 Mie型）。進(jìn)一步的研究，依據(jù)交叉中和試驗(yàn)，RNA 寡核苷酸指紋圖譜、基因序列以及單克隆抗體的交叉反應(yīng)性,可將乙腦病毒分為5 抗原組，即Nakayama2RFVL(分離自日本東京)、Kamiyama(分離自日本福岡)、691004(分離自斯里蘭卡)、Beijing21(分離自中國(guó)) 和 Muar (分離自新加坡)。近幾年，普遍采用Chen等建立的基因分型法對(duì)乙腦病毒進(jìn)行分型［12,13］。根據(jù)核酸序列的同源性，Chen等將乙腦病毒基因分型的cut-off值定為12%的差異度，從而得到進(jìn)化關(guān)系上較為明顯的4個(gè)型：泰國(guó)北部及柬埔寨地區(qū)分離的毒株屬于基因Ⅰ型；來(lái)自泰國(guó)南部、馬來(lái)西亞、印度尼西亞的毒株形成基因Ⅱ型；來(lái)自日本、中國(guó)等地區(qū)的毒株屬于基因Ⅲ型；部分印度尼西亞的毒株獨(dú)自形成了基因IV型［14］。有研究發(fā)現(xiàn)同一基因型的毒株在地域上有更為緊密的聯(lián)系，即有明顯的地域性，在同一地區(qū)分離的毒株即使年代相差很遠(yuǎn)也屬于同一基因型。但是近十多年來(lái)，乙腦病毒基因型的分布地區(qū)有了新的變化；中國(guó)大陸、韓國(guó)和日本已經(jīng)報(bào)道發(fā)現(xiàn)基因Ⅰ型乙腦病毒［15,16］；1995年澳大利亞首次出現(xiàn)乙腦病例，其后分離的毒株分別屬于基因Ⅰ型和Ⅱ型［17］。近幾年，我國(guó)對(duì)不同來(lái)源的乙腦病毒進(jìn)行了基因分型［16,18～21］，發(fā)現(xiàn)分離自我國(guó)的乙腦病毒絕大多數(shù)是Ⅲ型，并廣泛分布于各地乙腦疫區(qū)。也證實(shí)我國(guó)有1型乙腦病毒的分布，最早分離到1型病毒的時(shí)間為1977年，認(rèn)為1型病毒可能是輸入的。最近分離到的乙腦病毒大多為Ⅲ型，還從上海、遼寧和云南分離到1型病毒。臺(tái)灣對(duì)不同來(lái)源的47株病毒進(jìn)行研究，可分為1、2和3群（型）［22］。乙腦病毒4個(gè)型之間具有較強(qiáng)的交叉保護(hù)作用，在血清學(xué)和免疫學(xué)試驗(yàn)中也有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)，用血清學(xué)試驗(yàn)難以區(qū)分乙腦病毒的型別。
6 乙腦實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)
乙腦病毒抗體檢測(cè)方法較多，如血凝抑制、補(bǔ)體結(jié)合、中和、間接血凝抑制、乳膠凝集、酶聯(lián)免疫和免疫熒光試驗(yàn)等。其中酶聯(lián)免疫試驗(yàn)檢查IgM和IgG抗體是目前用于病人診斷較為常見(jiàn)的方法，由于乙腦病毒與其它黃病毒有交叉反應(yīng)，近年來(lái)由于采用乙腦病毒特異性蛋白制備抗原［23］，該法的特異性和敏感性均有較大提高。其它方法主要用于流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)研究中。病毒分離仍然使用細(xì)胞或小鼠法，由于分子生物學(xué)方法的發(fā)展和逐漸普及，病毒檢測(cè)更為簡(jiǎn)便和快速，培養(yǎng)物經(jīng)過(guò)血清學(xué)方法初步判定后，用RT-PCR法檢測(cè)乙腦病毒核酸即可作出準(zhǔn)確鑒定，通過(guò)序列測(cè)定分析可確定分離株的分子遺傳特征。實(shí)時(shí)熒光PCR和基因芯片技術(shù)的發(fā)展，為乙腦的診斷提供了更好的方法［24］。
7 乙腦疫苗及其應(yīng)用
控制乙腦流行的方法主要是滅蚊和疫苗接種。在蚊蟲(chóng)控制措施難以全面落實(shí)的情況下，疫苗接種成為控制乙腦流行最為有效的方法。目前，國(guó)內(nèi)外應(yīng)用的乙腦疫苗主要有滅活疫苗和減毒活疫苗兩種。滅活疫苗主要是鼠腦純化滅活疫苗和地鼠腎細(xì)胞滅活疫苗。鼠腦純化滅活疫苗是從感染鼠腦培養(yǎng)制備的，由日本研制生產(chǎn)并得到國(guó)際廣泛認(rèn)可和使用的疫苗；地鼠腎細(xì)胞滅活疫苗為我國(guó)生產(chǎn)，病毒經(jīng)原代地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)制備的疫苗，1998年開(kāi)始生產(chǎn)使用，隨后在全國(guó)大面積使用。近幾年，Vero細(xì)胞純化滅活疫苗已在研究生產(chǎn)，該疫苗為新一代的乙腦滅活疫苗，有較好的發(fā)展前景。減毒活疫苗主要是我國(guó)自主研制的乙腦SA14-14-2株，為目前唯一獲得認(rèn)可和推廣使用的乙腦活疫苗，自1989年獲得新藥證書(shū)以來(lái)，該疫苗產(chǎn)量不斷增多，并在全國(guó)廣泛使用已達(dá)3億多人份，該疫苗具有接種針次少、副反應(yīng)小、免疫原性高、免疫效果好等優(yōu)點(diǎn)而在國(guó)內(nèi)得到廣泛應(yīng)用并出口到韓國(guó)、尼泊爾和印度等亞洲國(guó)家使用［25,26］。然而，由于接種減毒活疫苗后，可在人體內(nèi)產(chǎn)生感染過(guò)程和出現(xiàn)病毒血癥，該疫苗病毒能否通過(guò)媒介蚊蟲(chóng)叮吸接種疫苗者的血液將病毒傳播給健康人而引起疾病，尤其是SA14-14-2病毒通過(guò)蚊蟲(chóng)增殖后其弱毒特性和基因型特征能否發(fā)生回復(fù)突變，毒力增強(qiáng)而發(fā)生病毒生態(tài)學(xué)改變等，仍然是世界衛(wèi)生組織及專家們最擔(dān)心和關(guān)注的問(wèn)題。最近，我國(guó)學(xué)者對(duì)現(xiàn)行使用的減毒活疫苗SA14-14-2病毒進(jìn)行了感染蚊蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)及安全性評(píng)價(jià)。研究認(rèn)為，作為乙腦主要傳播媒介的三帶喙庫(kù)蚊和致倦庫(kù)蚊對(duì)SA14-14-2疫苗株的經(jīng)口感染和病毒在蚊體內(nèi)的復(fù)制嚴(yán)重受限［27］，但經(jīng)胸腔接種SA14-14-2株后，病毒能在三帶喙庫(kù)蚊和致倦庫(kù)蚊體內(nèi)增殖［28,29］。而對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明，這兩種庫(kù)蚊無(wú)論經(jīng)口或胸腔接種野毒株均能在蚊體內(nèi)增殖，且蚊體內(nèi)病毒滴度較高。說(shuō)明減毒疫苗病毒已不具有在蚊蟲(chóng)中腸細(xì)胞增殖的特性，即使蚊蟲(chóng)按自然途徑（經(jīng)口）叮吸接種過(guò)乙腦減毒活疫苗SA14-14-2病毒的人或動(dòng)物血液后，疫苗病毒也不會(huì)在蚊體內(nèi)感染增殖，更不會(huì)引起疫苗病毒的傳播［27～29］，并以此推論媒介庫(kù)蚊叮吸被該活疫苗免疫的宿主動(dòng)物和人后，不會(huì)引起感染和傳播。雖然經(jīng)非自然途徑（胸腔接種），該疫苗病毒可在蚊體內(nèi)感染復(fù)制，但經(jīng)蚊體內(nèi)增殖后的疫苗病毒的弱毒特性未發(fā)生改變，并通過(guò)對(duì)該病毒E區(qū)的比較分析，獲得了SA14-14-2減毒株弱毒特性保持穩(wěn)定的分子基礎(chǔ)，完全符合現(xiàn)行國(guó)家藥典的規(guī)定［30］。該研究首次證實(shí)我國(guó)自行開(kāi)發(fā)的乙腦減毒活疫苗的應(yīng)用不會(huì)引起該病毒的生態(tài)學(xué)改變，廣泛使用該疫苗是安全的，對(duì)該疫苗安全性的證實(shí)將促進(jìn)該疫苗在全世界的推廣和使用。
基因工程疫苗是乙腦疫苗發(fā)展的方向，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在嵌合病毒疫苗、DNA疫苗、蛋白質(zhì)疫苗和亞病毒顆粒疫苗方面取得了一些進(jìn)展。如用乙腦SA14-14-2病毒的PrM和包膜E蛋白基因代替17D黃熱病毒cDNA的相應(yīng)序列，構(gòu)建了嵌合的減毒乙腦疫苗，免疫鼠和猴子具有安全性、免疫原性和保護(hù)作用［30］。用表達(dá)的乙腦病毒E蛋白（或含Prm和E 基因；Prm、E、NS1和NS2基因）的重組痘苗病毒免疫小鼠能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體及抗乙腦病毒攻擊［32］。DNA疫苗研究用構(gòu)建編碼乙腦病毒E蛋白的DNA質(zhì)粒接種小鼠，對(duì)攻擊感染有一定保護(hù)作用，但免疫鼠中未能檢出乙腦病毒抗體，而產(chǎn)生了低水平的乙腦病毒特異性T細(xì)胞增殖，認(rèn)為保護(hù)作用可能主要與細(xì)胞免疫有關(guān)［33,34］。另外的研究用構(gòu)建的含乙腦病毒Prm和E基因的質(zhì)粒免疫鼠，能產(chǎn)生較高水平的特異性中和抗體，并對(duì)乙腦病毒攻擊感染產(chǎn)生完全的保護(hù)，免疫豬能產(chǎn)生記憶B細(xì)胞和持續(xù)產(chǎn)生中和抗體，認(rèn)為該疫苗可作為第二代乙腦候選疫苗［32,35～37］。有的學(xué)者用乙腦病毒NS1基因的質(zhì)粒免疫小鼠，對(duì)乙腦病毒攻擊產(chǎn)生保護(hù)性免疫［38］。用乙腦病毒Prm和E蛋白組成的細(xì)胞外顆粒（EPs）免疫小鼠能產(chǎn)生特異的中和抗體和T淋巴細(xì)胞［39］。雖然基因工程疫苗有良好的發(fā)展前景，但在臨床使用前尚有很多問(wèn)題需要解決。
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